Importancia del sistema de dos componentes AbrA1/A2 de Streptomyces coelicolor en la producción de antibióticos y diferenciación mediante el uso de los mutantes carentes de sus genes

Grado en Biología realizado por Sergio Antoraz Martín en el Instituto de Biología Funcional y Genómica (CSIC-USAL).Peer Reviewe

Importancia del sistema de dos componentes AbrA1/A2 de Streptomyces coelicolor en la producción de antibióticos y diferenciación mediante el estudio de los mutantes carentes de sus genes

Trabajo de fin de grado. Grado en Biología. Curso académico...[ES]Las células, tanto procariotas como eucariotas, han desarrollado distintos sistemas de señalización para reconocer, integrar y responder a las múltiples variaciones del ambiente. La principal vía de señalización en bacterias son los sistemas de dos componentes (TCSs, del inglés Two Components Systems), los cuales también se han identificado en archaeas y en eucariotas como levaduras, hongos, protozoos y plantas, aunque de forma menos abundante. Curiosamente no se han hallado en genomas animales ya secuenciados, por lo que se podría considerar que no están presentes en el reino animal

Empleo de cepas de Streptomyces coelicolor mutadas en el sistema de dos componentes AbrA para la expresión heteróloga de rutas de antibióticos.

Trabajo de Fin de Máster del Máster en Biología y Conservación de la Diversidad, cursoLos antibióticos son compuestos de bajo peso molecular producidos generalmente por microorganismos que a bajas concentraciones son capaces de inhibir el crecimiento o matar a otros microorganismos. Se emplean frecuentemente en medicina para combatir enfermedades infecciosas y en investigación, donde son herramientas de gran utilidad, pero su uso también está extendido en agricultura y ganadería (Demain, 2014). Los antibióticos son en general productos de complejas rutas biosintéticas que presentan estructuras químicas y actividades biológicas muy variadas (Becker, 2013). Son productos del metabolismo secundario, por lo que no son esenciales para el crecimiento del organismo productor. No obstante, estos compuestos suelen conferir ventajas ecológicas y por lo tanto una mayor competitividad (Diminic et al., 2014). Aunque pueden ser sintetizados por algas, plantas superiores y hongos, la gran mayoría de los usados en clínica son producidos por bacterias (Demain, 2014). Dentro de este grupo cabe destacar un género por encima de los demás debido al número y la diversidad de los antibióticos que produce: Streptomyces. El desarrollo de resistencias a los antibióticos por parte de distintos microorganismos patógenos se ha convertido en una grave amenaza para la salud. Aunque actualmente se están desarrollando diferentes alternativas para combatir enfermedades infecciosas (Mandal et al., 2014; Nigam et al., 2014), la aplicación de antibióticos sigue siendo la principal solución para combatir infecciones. Por ello no sólo se hace necesario investigar nuevos compuestos con actividades antibióticas, sino también desarrollar las herramientas biológicas necesarias para optimizar su producción

Mejora genética de cepas de streptomyces coelicolor para la producción de metabolitos secundarios mediante el estudio de su regulación por sistemas de dos componentes

[ES] Streptomyces es un género de bacterias Gram positivas cuyo hábitat principal es el suelo y que es especialmente valorado por su importancia como productor tanto de enzimas como de compuestos bioactivos (antibióticos, antitumorales, antifúngicos…). La utilización de técnicas de ingeniería genética que permitan estudiar y actuar sobre las complejas redes regulatorias de estos productos para mejorar su síntesis es una de las aproximaciones empleadas para obtener nuevos compuestos con este tipo de actividades, así como para mejorar su producción. Los sistemas de dos componentes son la principal vía de señalización de bacterias: se componen de una histidina quinasa responsable de captar un determinado estimulo y un regulador de respuesta, y están relacionados tanto con producción de metabolitos secundarios como con diferenciación morfológica. De esta manera su eliminación o sobreexpresión puede ayudar a generar cepas que produzcan mayores cantidades de dichos compuestos, tanto propios como expresados de forma heteróloga. Durante este trabajo se ha generado una batería de 21 mutantes de Streptomyces coelicolor, la especie más estudiada del género, en dos sistemas de dos componentes (AbrA y AbrB) y una histidina quinasa (AbrC1) (Yepes et al., PLoS One 2011; 6(5): e19980)

Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal

Emergence of antibiotic resistant pathogens is changing the way scientists look for new antibiotic compounds. This race against the increased prevalence of multi-resistant strains makes it necessary to expedite the search for new compounds with antibiotic activity and to increase the production of the known. Here, we review a variety of new scientific approaches aiming to enhance antibiotic production in Streptomyces. These include: (i) elucidation of the signals that trigger the antibiotic biosynthetic pathways to improve culture media, (ii) bacterial hormone studies aiming to reproduce intra and interspecific communications resulting in antibiotic burst, (iii) co-cultures to mimic competition-collaboration scenarios in nature, and (iv) the very recent in situ search for antibiotics that might be applied in Streptomyces natural habitats. These new research strategies combined with new analytical and molecular techniques should accelerate the discovery process when the urgency for new compounds is higher than ever.Our laboratory is funded by: The Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) [BFU2010-17551] and the Junta de Castilla y León (JCyL) CSI099A12-1.Peer Reviewe

The two kinases, AbrC1 and AbrC2, of the atypical two-component system AbrC are needed to regulate antibiotic production and differentiation in Streptomyces coelicolor

Two-component systems (TCSs) are the most important sensing mechanisms in bacteria. In Streptomyces, TCSs-mediated responses to environmental stimuli are involved in the regulation of antibiotic production. This study examines the individual role of two histidine kinases (HKs), AbrC1 and AbrC2, which form part of an atypical TCS in Streptomyces coelicolor. qRT-PCR analysis of the expression of both kinases demonstrated that both are expressed at similar levels in NB and NMMP media. Single deletion of abrC1 elicited a significant increase in antibiotic production, while deletion of abrC2 did not have any clear effect. The origin of this phenotype, probably related to the differential phosphorylation ability of the two kinases, was also explored indirectly, analyzing the toxic phenotypes associated with high levels of phosphorylated RR. The higher the AbrC3 regulator phosphorylation rate, the greater the cell toxicity. For the first time, the present work shows in Streptomyces the combined involvement of two different HKs in the response of a regulator to environmental signals. Regarding the possible applications of this research, the fact that an abrC1 deletion mutant overproduces three of the S. coelicolor antibiotics makes this strain an excellent candidate as a host for the heterologous production of secondary metabolites.Our research was funded by grants CSI099A12-1 from the Junta de Castilla y León to RS and BFU2010-17551 from the MICINN to MD. SR had a JAE-PreDoc grant from the CSIC. HR had a postdoctoral fellowship from the Botín Foundation.Peer Reviewe

The orphan response regulator Aor1 from Streptomyces coelicolor is a new piece in the puzzle of the regulation network of antibiotic production

Resumen del trabajo presentado al 7th Congress of European Microbiologists, celebrado en Valencia (España) del 9 al 13 de julio de 2017.[Backgrounds]: Antibiotic production in Streptomyces coelicolor responds to different environmental signals, both physicals (pH, temperature...) and chemicals (nutrients, activators...), through a complex signalling network. Recognisance of these stimuli is performed mainly through Two Component Systems (TCS). Usually, TCSs are composed by a histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), forming a single operon in the genome, but also exist HKs and RRs without its partner, the so-called orphans. Presence of orphan genes may serve as a way of increasing the response capacity in the cell, expanding regulatory network's complexity. [Objectives]: In this work we try to elucidate the role of one of these orphan regulators, Aor1 (Antibiotic Orphan Regulator), that apparently has great importance in antibiotic production in S. coelicolor and differentiation. [Methods]: We have obtained the deletion mutant (ΔSCO2281) in S. coelicolor that allowed us to demonstrate that this orphan RR is involved in the positive regulation of antibiotic production and differentiation. This mutant is drastically affected in endogenous antibiotic biosynthesis of actinorhodin, undecilprodigiosin and calcium dependent antibiotic. We have also evidence that shows a possible relation between this RR and the TCS AbrC. On the other hand, we have demonstrated, by q-RTPCR, that gene aor1 is part of a four gene operon (SCO2279-2282). [Conclusions]: RR Aor1 seems to have an important role in antibiotic production in S. coelicolor, and its study adds significant information about this main piece in the puzzle that could serve for unveiling the complex antibiotic regulatory network in Streptomyces.Peer Reviewe

Regulation of the AbrA1/A2 Two-Component System in Streptomyces coelicolor and the Potential of Its Deletion Strain as a Heterologous Host for Antibiotic Production

The Two-Component System (TCS) AbrA1/A2 from Streptomyces coelicolor M145 is a negative regulator of antibiotic production and morphological differentiation. In this work we show that it is able to auto-regulate its expression, exerting a positive induction of its own operon promoter, and that its activation is dependent on the presence of iron. The overexpression of the abrA2 response regulator (RR) gene in the mutant DabrA1/A2 results in a toxic phenotype. The reason is an excess of phosphorylated AbrA2, as shown by phosphoablative and phosphomimetic AbrA2 mutants. Therefore, non-cognate histidine kinases (HKs) or small phospho-donors may be responsible for AbrA2 phosphorylation in vivo. The results suggest that in the parent strain S. coelicolor M145 the correct amount of phosphorylated AbrA2 is adjusted through the phosphorylation-dephosphorylation activity rate of the HK AbrA1. Furthermore, the ABC transporter system, which is part of the four-gene operon comprising AbrA1/A2, is necessary to de-repress antibiotic production in the TCS null mutant. Finally, in order to test the possible biotechnological applications of the DabrA1/A2 strain, we demonstrate that the production of the antitumoral antibiotic oviedomycin is duplicated in this strain as compared with the production obtained in the wild type, showing that this strain is a good host for heterologous antibiotic production. Thus, this genetically modified strain could be interesting for the biotechnology industry

Importancia de los mutantes individuales del sistema de dos componentes AbrA1/A2 de Streptomyces coelicolor en la producción de antibióticos y diferenciación

Resumen del trabajo presentado a la X Reunión de Microbiología Molecular celebrada en Segovia del 9 al 11 de junio de 2014.[Introducción]: El género Streptomyces es el mayor productor de antibióticos conocido. Dicha producción se encuentra altamente regulada a diferentes niveles, lo cual le permite responder rápidamente a las variables condiciones nutricionales y físico-químicas que encuentra en su hábitat natural, el suelo. Los Sistemas de Dos Componentes (SDC), constituyen la principal vía de señalización en bacterias y están formados por una Histidina Quinasa (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previamente en nuestro laboratorio se identificó el sistema AbrA1/A2 en Streptomyces coelicolor, un SDC que forma parte de un operón junto a otros dos genes que codifican un sistema de transporte ABC. La deleción del sistema AbrA1/A2 produce un aumento de la producción de los antibióticos actinorrodina (ACT), undecilprodigiosina (RED) y antibiótico dependiente de calcio (CDA), así como acelera la diferenciación morfológica. En este trabajo se estudió la importancia de la HK AbrA1 y del RR AbrA2 por separado en la producción de antibióticos en S.coelicolor. [Métodos]: Los mutantes ΔabrA1 y ΔabrA2 se obtuvieron reemplazando dichos genes por un cassette de resistencia a apramicina y fueron comprobados por Southern Blot. El análisis morfológico de los mutantes se realizó en diferentes medios tanto sólidos como líquidos.[Resultados]: El fenotipo de los mutantes individuales resultó altamente dependiente del medio. Aunque en algún caso ambos presentaban fenotipos similares al mutante doble ΔabrA1/A2, mayor producción de ACT, RED y CDA, en otros el mutante de la HK era parecido a la cepa silvestre, o ambos mutantes presentaban un fenotipo intermedio entre la cepa silvestre y el mutante de todo el sistema. Durante este estudio también se observó un retraso en la germinación de los mutantes ΔabrA1/A2 y ΔabrA2. Sin embargo, no presentaban diferencias en las curvas de crecimiento obtenidas durante varios días. [Conclusiones]: La eliminación de tan sólo uno de los componentes del sistema en la mayoría de los casos no conlleva un fenotipo como el del mutante doble, por lo que en esos casos podría estar dándose una regulación cruzada con otras HK o RR ajenos al sistema AbrA1/A2. La red reguladora de Streptomyces adquiere por lo tanto un mayor nivel de complejidad si tenemos en cuenta las posibles interacciones entre los componentes de distintos sistemas.Peer Reviewe

Nuevos reguladores de la producción de antibióticos en Streptomyces

Resumen del trabajo presentado al VI Congreso de Microbiología Industrial y Biotecnología Microbiana, celebrado en León (España) del 12 al 14 de septiembre de 2016.Las bacterias del género Streptomyces poseen un elevado potencial industrial debido a su capacidad para producir moléculas con interés en clínica, en veterinaria, o con interés fitosanitario. La secuenciación del genoma de un amplio número de especies de este género ha permitido corroborar que este potencial es aún mas amplio que el observado en el laboratorio ya que todas ellas tienen capacidad para producir más de 20 compuestos de los que únicamente una pequeña parte es producida en las condiciones de cultivo empleadas. El activar estas rutas silenciadas ha atraído a gran numero de investigadores y son variadas las estrategias abordadas para intentar su activación sin que hasta la fecha se haya encontrado una estrategia general para activarlas. Nuestro grupo esta estudiando la regulación que ejercen varios sistemas de dos componentes (SDC) sobre la producción de antibióticos empleando como organismo modelo Streptomyces coelicolor. A lo largo de este estudio hemos identificado dos SDCs que regulan negativamente la producción de antibióticos y la diferenciación y un sistema que actúa como un regulador positivo en ambos procesos. Este último sistema es un SDC especial al contener dos histidina kinasas (HK) y un único regulador de respuesta (RR) al que, las dos HKs del sistema, parecen controlar de modo diferente. La generación de cepas delecionadas en los SDC negativos y su empleo como cepas hospedadoras de rutas heterólogas ha permitido comprobar que esta es una buena estrategia para incrementar la producción heteróloga de compuestos ya conocidos. Por otro lado, hemos demostrado el gran potencial que supone la sobreexpresión del RR del SDC positivo en otros organismos para estimular la producción de sus metabolitos secundarios endógenos. Actualmente hemos extendido este estudio a otras proteínas con capacidad de unión a DNA observando que la producción de antibióticos puede verse modificada drásticamente por la sobreexpresión de alguna de estas proteínas.Peer Reviewe